Electroforeza capilară SEBIA

 

Firma SEBIA Franta este firma producatoare de sisteme de electroforeza din lume care a lansat o linie completa dedicata determinarii Hb A1c prin electroforeza capilara. Aceasta contine trei sisteme automate de electroforeza (Fig.1), dedicate tututor tipurilor de laboaratoare: Minicap Flex Piercing pentru laboratoarele de mici dimensiuni si Capillarys 2 Flex Piercing pentru laboratoarele medii si mari. Lansat în prima jumatate a acestui an, Capillarys 3 Tera este cel mai nou dintre sisteme destinat, de asemenea, tot laboratoarelor mari. Toate cele 3 aparate sunt disponibile si în Romania. In egala masura, toate sistemele de electroforeza SEBIA utilizate în determinarea Hb A1c sunt certificate NGSP si participa la monitorizarea bianuala a Colegiului Patologilor Americani de pe lânga NGSP (CAP proficiency survey). De asemenea, în premiera, se poate lucra pe toate tipurile de tuburi de recolta (normale si pediatrice), dar si pe capilare din sticla (Fig.2).

 

Principiul metodei

Electroforeza capilara în sistem SEBIA determina exclusiv  Hb A1c  (fractiunea de Hb ce a legat non-enzimatic glucoza la resturile de valina N-terminale ale lanturilor ß) sub forma unui peak total separat de celelalte hemoglobine glicate Hb A1a si Hb A1b. In electroforeza capilara în solutie libera, hemoglobinele se separa în capilare de silica, pe baza mobilitatii electroforetice si a fluxului electroosmotic, la voltaj mare si în tampon alcalin. Separarea Hb A1c se face la 9400 V, fracţiunile fiind detectate si cuantificate prin densitometrare la 415 nm, în următoarea ordine: Hb A2/ C, E, S, D, F, A0, A1 minor glicozilate, Hb A1c. În paralel cu densitometrarea se realizează şi un calcul automat al raportului

 

Hb A1c/ (Hb A1c + Hb A0)

cu exprimarea rezultatelor atât în unităţi IFCC(mmol/ mol Hb), cât şi în unităti NGSP (%), în acord cu noile recomandări ale American Diabetes Association şi OMS. De asemenea, în acord cu recomandarile IFCC, se utilizeaza calibratori ce contin un amestec de Hb A1c si Hb A0 înalt purificate.

 

Tiparul electroforetic normal relevă prezenţa a 3 fracţiuni: Hb A0, Hb A1c si Hb A2 (Fig.62). În egală măsură se pot separa şi alte variante ale Hb A1 (cum ar fi cea legată de vârstă), Hb A1c oxidată sau fracţiunile minor glicozilate Hb A1a+b (cele obţinute prin legarea hemoglobinei de fructozo 1,6- bi fosfat, glucozo 6 fosfat sau piruvat) (Fig.3).

 

Interferente analitice

Electroforeza calipara în sistem automat SEBIA înlatura principalele interferente analitice în determinarea Hb A1c. Hb A1c labilă şi varianta carbamilată a hemoglobinei (Fig.4), principalii factori de interferenţă în determinarea HbA1c sunt detectate în zona Hb A0, determinând obţinerea unor rezultate de mare acurateţe. Spre deosebire de HPLC, electroforeza capilara în sistem SEBIA înlatura si interferenta variantei acetilate a Hb (care se separa distinct de Hb A1c).

Posibilitatea separarii variantelor anormale de Hb  (HbS, Hb C, Hb D, HbE) ca fractiuni distincte creaza premisele screening-ului si diagnosticului eventualelor hemoglobinopatii cu ocazia determinarii Hb A1c (Fig.5). Rezultatele obtinute prin cele doua metode (determinarea Hb A1c si electroforeza hemoglobinei) au fost perfect comparabile (Fig.6-7).

 

Sisteme automate SEBIA de determinare a Hb A1c

SEBIA Franta pune la dispozitia clientilor 3 sisteme automate de electroforeza capilara destinata separarii si cuantificarii Hb A1c:

 

Caracteristicile principale ale acestor sisteme sunt:

 

Tip de aparat                 Cadenta       
Minicap Flex Piercing 8 teste/h
Capillarys 2Flex Piercing 38 teste/h
Capillarys 3 Tera 70 teste/h

Tabel 1. Cadenta de lucru pentru determinarea Hb A1c pentru sistemele automate de electroforeza capilara SEBIA.

 

Performantele electroforezei capilare SEBIA în determinarea Hb A1c

Peformantele metodei de determinare SEBIA au fost evidentiate de numeroase studii date publicitatii în ultimii ani.

Prima evaluare a sistemului automat Capillarys 2 Flex Piercing a fost efectuata în anul 2012 de un grup de lucru de la Reims Franta si a evidentiat:

 

Rezultatele acestei prime evaluari au fost confirmate de alte studii multicentrice comparative între electroforeza capilara SEBIA si HPLC. Studiul unui grup de cercetatori [MARINOVA] publicat în 2013 a evidentiat un CV <3.4% (în cazul raportarii în unitati IFCC) si <2.1% (în cazul raportarii în unitati NGSP) pentru metoda electroforetica SEBIA spre deosebire de CV< 3.1% (unitati IFCC) si <2% (unitati NGSP) in cazul utilizarii HPLC.

 

Rezultatele monitorizarii CAP (Colegiului Patologilor Americani) acreditata de NGSP

Inca de la lansarea pe piata si certificarea NGSP, SEBIA a participat la toate programele de monitorizare efectuate de CAP, cu rezultate excelente.

Datele publicate pe site-ul oficial al NGSP releva în 2015 obtinerea unui CV cuprins între 1.6% si 2.7% pentru 5 nivele diferite de Hb A1c cuprinse între 5.32% si 10.28%. De mentionat ca programul de monitorizare a cuprins atât sistemul Minicap Flex Piercing, cât si Capillarys 2 Flex Piercing si ca valoarea tinta a CV a fost 3%. Aceleasi rezultate excelente (CV≤ 2%) au fost obtinute si în 2014. Rezultatele sunt accesibile pe site-ul www.ngsp.org.

 

In concluzie, DE CE determinarea Hb A1c prin electroforeza capilara SEBIA?

Pentru ca asigura:

 

1a. Minicap Flex Piercing (dupa SEBIA)
1a. Minicap Flex Piercing (dupa SEBIA)

 

1 b. Capillarys 2 Flex Piercing (dupa SEBIA)
1 b. Capillarys 2 Flex Piercing (dupa SEBIA)

 

 

1.c Capillarys 3 Tera (dupa SEBIA)
1.c Capillarys 3 Tera (dupa SEBIA)

Fig. 1. Sisteme automate de electroforeza capilara pentru determinarea Hb A1c.

Fig2 Determinarea Hb A1c
Fig. 2. Determinarea Hb A1c prin electroforeza capilara SEBIA este disponibila si pe sânge recoltat în capilare de sticla (dupa SEBIA). Kit-ul contine: capilare de sticla, tuburi de transport cu solutie hemolizanta si clema pentru prinderea capilarului de sticla./p>

3
Fig. 3.  Determinarea Hb A1c prin electroforeză capilară (după SEBIA). Tiparul electroforetic normal relevă prezenţa a trei fracţiuni: Hb A0, Hb A1c si Hb A2. Unele variante ale Hb A1 (cum ar fi cea legată de vârstă), Hb A1c oxidată sau fracţiunile minor glicozilate (cele obţinute prin legarea hemoglobinei de fructozo 1,6- bi fosfat, glucozo 6 fosfat sau piruvat) se pot separa ca fracţiuni distincte. Kitul Capillarys Hb A1c  este singurul kit destinat determinarii Hb A1c care realizează şi o separare şi determinare de Hb A2, putându-se depista astfel o eventuala talasemie la un control de rutină pentru diabet./p>

4
Fig. 4.  Aspectul curbei electroforetice la separarea Hb A1c prin electroforeza capilară în prezenţa variantelor carbamilate ale Hb (după SEBIA). Carbamilarea hemoglobinei este un proces biochimic ce se produce în statusul uremic. Acidul izocianic rezultat în urma degradării ureei se leagă la Val N-terminală cu formare de hemoglobină carbamilată. Profilul electroforetic obţinut prin electrofreză capilară relevă fără echivoc o bună separare a Hb A1c în prezenţa variantelor carbamilate de Hb./p>

5
Fig. 5.   Aspectul curbei electroforetice la separarea Hb A1c prin electroforeză capilară în prezenţa Hb S (după SEBIA). Hb S nu interferă în determinarea Hb A1c, electrofreza capilară permiţând o bună separare a celor două hemoglobine./p>

6
Fig.. 6. Comparatie între modelul electroforetic obtinut prin utilizarea kit-ului Hb A1c si cel pentru electroforeza capilara (dupa SEBIA)./p>

7
Fig. 7. Aspectul curbei electroforetice pentru Hb A1c în prezenta variantelor anormale de Hb. Se observa lipsa de interferenta în determinarea Hb A1c (dupa SEBIA)./p>

8
Fig. 8.  Aspectul electroforegramelor pentru probele de Hb A1c identificate pe cod de culoare si dispuse sub forma de mozaic/p>

 

Bibliografie selectiva

 

  1. – Chiva A.- Actualităţi în diagnosticul electroforetic de laborator, Ed. Universitară “Carol Davila”, 2011.
  2. – Chiva A-  Hemoglobina glicozilata si diabetul zaharat.Revista Galenus, Nr.65, 6-8, 2012.
  3. – Heylen O et al.- Evaluation of the Sebia CAPILLARYS 2 flex piercing for the measurements of Hb A1c on venous and capillary blood sample. Am J Clin Pathol 2014; 141 (6): 867-77.
  4. – Jaisson S, Leroy N, Meurice J, Guillard E, Gillery P.- First evaluation of Capillarys 2 Flex Piercing® (Sebia) as a new analyzer for Hb A1c assay by capillary electrophoresis. Clin Chem Lab Med 2012 1;50 (10):1769-75.
  5. – Jaisson S et al. Interference of the most frequent haemoglobin variants on the quantification of Hb A1c: caomparison between the lc-ms (ifcc reference method) and three routinely used method. Diabetes Metab 2013; 39 (4): 363-9.
  6. – Marinova M et al.- Multicentric evaluation of hemoglobin A1c assay on capillary electrophoresis. Clin Chem Acta 2013 23; 424:207- 11.
  7. www.ngsp.org/CAPdata.asp