Interferenţe în determinarea Hb A1c

Literatura de specialitate citează numeroşi factori de interferenţă pentru Hb A1c. Unii pot altera in vivo valoarea Hb A1, în timp ce alţi factori interferă în metoda de determinare. La aceştia se adaugă şi factorii genetici sau cei legaţi de vârstă, dietă, variaţii sezoniere.

Modificarea cantităţii de glucoză ce penetrează eritocitele,  a ratei de glicozilare şi a duratei medii de viaţă a hematiei determină modificarea in vivo a Hb A1c. În general, aceşti factori determină o creştere a Hb A1c, cu excepţia sarcinii, anemiei hemolitice, hemoragiilor recente şi administrării de vitamină C care determină false scăderi (Tabel 1).

Cele mai importante interferenţe sunt cele care intervin în metoda de determinare (Tabel 2). Hb A1c labilă (produsă în condiţii fiziologice post-prandial sau care poate apare în cazul unui control glicemic precar şi care prezintă o mare variabilitate inter-individuală), variantele carbamilate (ce apar la pacienţii cu status uremic) şi acetilate (întâlnite în sarcină, consum cronic de alcool sau după administrare de aspirină) ale hemoglobinei şi  prezenţa hemoglobinelor patologice (Hb S, Hb C, Hb D, Hb E sau persistenţa ereditară de Hb F) constituie interferente majore ce fac de multe ori dificilă monitorizarea pacienţilor cu diabet (în special asociat cu hemoglobinopatii sau insuficienţă renală).

Interferenţele în metodele bazate pe diferenţa de sarcină electrică se manifestă prin coeluare şi comigrare a Hb A1c şi a altor hemoglobine. De exemplu, ureea reacţionează cu hemoglobina (cu formare de Hb carbamilată) în acelasi situs ca şi glucoza. Ca urmare, punctele izoelectrice ale Hb A1c si  Hb carbamilată vor fi aceleaşi şi cele două hemoglobine vor migra împreună în gelul de agaroză, dar nu şi în electroforeza capilară.

Interferenţele în metodele imunologice se explică prin aceea ca orice hemoglobină ce a suferit substituţia unor aminoacizi la capatul N terminal al lantului β este recunoscută ca anticorp anti Hb A1c.

În pofida existenţei unei game variate de metode de determinare a Hb A1c, aceste interferenţe diminuează acurateţea rezultatelor şi fac dificilă monitorizarea tratamentului şi a riscului de complicaţii. Metodele electroforetice (în special electroforeza capilară în sistemul Capillarys 2 Flex Piercing SEBIA Franta) înlatură cu succes aceste interferenţe.

Din aceste motive, monitorizarea pacienţilor diabetici pe baza Hb A1c trebuie facută prin determinarea ei folosind tehnici electroforetice (în special electroforeza capilară) şi interpretarea rezultatelor prin coroborarea cu istoricul pacientului şi alte teste de laborator.

 

Tabel  1.  Factori de interferenţă pentru Hb A1c şi mecanismul lor de producere
Modificarea cantităţii de glucoză ce penetrează eritrocitele

  • Glicemia
  • Permeabilitatea membranei eritrocitare

 

Modificarea ratei de glicozilare

  • Administrarea îndelungată de aspirină, vitamina C şi E
  • Stress oxidativ

 

Modificarea duratei medii de viaţă a hematiei

  • Anemie feriprivă, hemolitică, hemoragii recente
  • Sarcina
  • Consum cronic de alcool
  • Insuficienţă renală
  • Talasemie
  • Hemoglobinopatii
  • Deficit de fier şi vitamina B12
  • Afecţiuni hepatice cronice

 

Tabel 2. Factori de interferenţă în metoda de determinare a Hb A1c
  • Hemoglobinopatii
  • Hemoglobina acetilată şi carbamilată
  • Hipertrigliceridemie
  • Hiperbilirubinemie
  • Consum cronic de alcool

 

Cazuri speciale şi interferenţe (Tabel 3)

Interpretarea corectă a valorilor Hb A1c determinate electroforetic trebuie facută ţinând cont de anumite cazuri speciale şi interferenţe. Acestea se referă atât la situaţii fiziologice şi patologice, cât şi la modul de recoltare şi  păstrare a probelor.

Condiţiile de recoltare şi păstrare a probelor

Probele recoltate pe anticoagulante pe baza de iodoacetat sau păstrarea sângelui (sau a hematiilor spălate) mai mult de 5 zile pot prezenta valori mai mari ale Hb A1c datorită unor acumulări de glucoză intraeritrocitar.

Variaţiile diurne şi sezoniere

Hb A1c nu prezintă variaţii diurne. În schimb, cercetătorii sunt unanimi în a recunoaşte variaţiile sezoniere ale Hb A1c. În acest sens, este notabilă constatarea că Hb A1c este mai crescută iarna decât vara şi că, regiunile cu ierni geroase şi lungi prezintă o diferenţă mai mare a valorilor Hb A1c între vara şi iarna decât în zonele cu ierni mai blânde. Astfel valorile Hb A1c sunt mai mari la sfârşit de toamnă şi început de iarnă decât la sfârşit de primavară şi început de vară. Aceste variaţii par a fi în strânsă legatură cu variaţiile sezoniere ale glicemiei, dietei, greutăţii corporale, temperaturii şi ratei de creştere (în cazul copiilor).

 

Vârstă, sex, rasă

Monitorizarea lunarǎ, timp de 2 ani, a valorii Hb A1c la diabetici, a demonstrat că diferenţele în funcţie de sex şi rasă sunt nesemnificative. Valoarea Hb A1c creşte odată cu vârsta ca urmare a creşterii ratei de glicozilare.

 

Sarcina

La gravide interferenţa este dublă. Pe de o parte trebuie avut în vedere faptul că valori ale Hb A1c ≥7% pot afecta cuantificarea fracţiunii de Hb A1c. Pe de altă parte, studiile efectuate pe gravide de ultim trimestru (începând cu luna a 8 a), valorile Hb A1c sunt mai mici cu aproximativ 2% faţă de normal.

 

Anomaliile calitative şi cantitative ale hemoglobinei

În aceasta categorie intră hemoglobinopatiile, anemia feriprivă, anemia hemolitică şi hemoragiile recente.

Interferenţa hemoglobinopatiilor în determinarea Hb A1c a fost evidenţiată prin studii asupra subiecţilor cu glicemie normală, dar cu valori ale Hb A1c mari. Aceştia prezentau invariabil diverse hemoglobinopatii, valoarea Hb A1c supradimensionată nefiind altceva decât suma dintre Hb A1c “adevărată” şi cea  a unor hemoglobine anormale cu aceeaşi mobilitate electroforetică ca şi Hb A1c. De aceea, prezenţa unor valori mari ale Hb A1c în condiţii de glicemie normală impune continuarea investigaţiei în vederea evidenţierii unor eventuale hemoglobinopatii. După cum am mai arătat, metodele electroforetice de analiză, înlătură acest neajuns, acestea permiţând separarea Hb F de Hb A1c, cu evidenţierea simultană a unor hemoglobine patologice. Dacă nu ţinem cont de prezenţa acestor hemoglobinopatii, există riscul unui diagnostic şi tratament greşite, cu inducerea stării de hipoglicemie. β talasemia asociată  cu Hb F≥    7 % conduce la false creşteri ale valorilor Hb A1c.

Supradimensionarea valorilor Hb A1c este caracteristică şi noului născut (la care Hb F este mai mare decât normalul) sau în cazul prezenţei Hb S.

În cazul diabetului asociat  cu β talasemie, valorile Hb A1c se menţin sub 6%, monitorizarea diabetului făcându-se pe baza fructozaminei.

Datorită diverselor variante anormale de hemoglobine şi a originii lor etnice, recomandăm ca fiecare laborator să stabilească propriul protocol de investigare a Hb A1c şi propriul domeniu de valori normale. Cunoaşterea influenţei diverselor hemoglobinopatii în determinarea Hb A1c este deci, esenţială, deoarece aceste variante pot prejudicia tratamentul instituit prin rezultate false ale Hb A1c.

Anemia feriprivă  afectează nivelul Hb A1c, acesta fiind uşor crescut (7.4% în medie) faţă de  normal (5.9%). Administrarea tratamentului corectiv cu fier conduce la o scădere a Hb A1c la 6.2% ± 0.6. Toate aceste observaţii pledează pentru o corecţie a anemiei înainte de luarea vreunei decizii de diagnostic sau tratament. S-a demonstrat că valoarea Hb A1c poate face distincţia între anemia feriprivă şi talasemia minoră, valoarea Hb A1c fiind mai mică în talasemie decât în anemia feriprivă. Toate aceste date sugerează faptul că Hb A1c poate fi unul dintre testele de elecţie dintre anemia feriprivă şi β talasemie. Deşi studiile în domeniul trebuie continuate, teza conform căreia   Hb A1c este un parametru important în condiţiile coexistenţei celor două afecţiuni, pare a fi clinic importantă.

Anemia hemolitică, policitemia vera şi statusul post-splenectomie  interferă în determinarea Hb A1c ca urmare a scăderii duratei de viaţă a hematiilor, ducând la subevaluarea Hb A1c.

Hemoragiile recente pot determina, de asemenea, subevaluarea Hb A1c într-o proporţie dependentă de rata de reînnoire a eritrocitelor.

 

Uremia (statusul uremic) şi insuficienţa renală

La diabeticii cu uremie mare, procesul de glicozilare a hemoglobinei poate interfera cu cel de carbamilare, ambele reacţii implicând gruparile amino libere ale proteinelor. S-a demonstrat că in vivo fiecǎrui mol/L de uree serică îi corespunde o cantitate de hemoglobină carbamilată echivalentă a 0.063% din totalul hemoglobinei Acest mecanism biochimic ar explica valorile supraevaluate ale Hb A1c determinată electroforetic la pacientii uremici, cromatografia şi tehnicile imunoenzimatice rămanând fără efect datorită posibilităţii decelării strict a fracţiunilor glicozilate, nu şi a celei carbamilate sau acetilate.

 

Interferenţe medicamentoase

Aspirina produce false creşteri ale valorilor Hb A1c printr-un mecanism de acetilare la restul de beta-Lys 82. Falsa creştere este evidentă numai în cazul metodei electroforetice si HPLC, focusarea izoelectrică putând face distincţia între hemoglobina glicozilată şi cea acetilată.

Vitamina C (acidul ascorbic) poate reacţiona cu hemoglobina şi, prin aceasta să interfere în determinarea Hb A1c. Administrarea de vitamină C inhibă glicozilarea, conducând astfel la o subevaluare a Hb A1c. Modul de interferenţă a vitaminei C în determinarea Hb A1c depinde de metoda folosită. Studiul comparativ a metodelor electroforetice şi cromatografice a demonstrat că, în timp ce valorile Hb A1c determinate cromatografic scad cu aproximativ 18% după tratamentul cu vitamină C timp de 3 luni, Hb A1c determinată electroforetic creşte cu aproximativ 16%. Diferenţele provin din faptul că metodele cromatografice sunt capabile să deceleze numai fracţiunile “adevărat” glicozilate.

 

CAZURI SPECIALE Valori  Hb A1c
Condiţii de recoltare anticoagulante pe bază de iodoacetat fals crescute
 şi păstrare a probelor păstrarea mai mult de 5 zile a probelor fals crescute
  variaţii sezoniere fals crescute
Situaţii fiziologice vârstă uşor crescute
       rasă fără efect
  sarcină fals scăzute
Situaţii patologice hemoglobinopatii fals crescute
anemie feriprivă (înainte de tratament) fals crescute
anemie feriprivă (după tratament) normalizare valori
anemie hemolitică fals scăzute
hemoragii recente fals scăzute
status uremic şi insuficienţă renală fals crescute
tratament cu aspirină fals crescute
tratament cu vitamină C fals scăzute

Tabel 3. Cazuri speciale şi interferenţe în determinarea electroforetică a Hb A1c.

 

Bibliografie selectiva

 

  1. www.ngsp.org/factors.asp
  2. – A.Chiva- Investigatia electroforetica in diagnosticul de laborator-ghid de interpretare-Ed. Universitara « Carol Davila », Bucuresti, 2008.
  3. – Chiva A.- Actualităţi în diagnosticul electroforetic de laborator, Ed. Universitară “Carol Davila”, 2011.
  4. – Chiva A-  Hemoglobina glicozilata si diabetul zaharat. 2012 Revista Galenus, Nr.65.
  5. – Dati F, Metzmann E-Proteins- Laboratory testing and clinical use- DyaSys Diagnostic Systems GmbH, 2005.
  6. – Hare MJL, Shaw JE, Zimmet PZ- Current controversies in the use of haemoglobin A1c. J Intern Med 2012;271:227-236.
  7. – Jaisson S, Leroy N, Meurice J, Guillard E, Gillery P.- First evaluation of Capillarys 2 Flex Piercing® (Sebia) as a new analyzer for Hb A1c assay by capillary electrophoresis. Clin Chem Lab Med 2012 1;50 (10):1769-75.
  8. – Little RR. Rohlfing CL, et al. Effects of hemoglobin Hb E and Hb D traits on measurements of glycated hemoglobin (Hb A1c) by 23 metdods. Clin Chem. 2008; 54:1277-1282.
  9. – Little RR, et al. Measurement of Hb A1c in patients with chronic renal failure. Clin Chem Acta 2013 15;418: 73-6.
  10. – Mostafa SA et al..- Should glycated haemoglobin (Hb A1c) be used to detect people with type 2 diabetes mellitus and impaired glucose regulation? Postgrad Med J 2010;86:656-662.
  11. – Mostafa SA et al.- The potential impact and optimal cut points of using glycated haemoglobin  Hb A1c to detect people with impaired glucose regulation in a UK multi-ethnic cohort. Diabetes Res Clin Pract 2010; 90(1):100-8.
  12. – Urrechaga E- High resolution Hb A1c separation and hemoglobinopathy detection with capillary electrophoresis. Am J Clin Pathol 2012; 138:448-456.