Metode de determinare a Hb A1c

 

Metodele de determinare a Hb A1c se împart în două categorii (Tabel 1), functie de principiul metodei:

 

HPLC cuplat cu spectrometria de masa sau electroforeza capilara sunt considerate de IFCC metode de referinta.

În pofida diversităţii lor, interferenţele prezentate anterior limitează utilizarea multor tehnici în practica de zi cu zi. Metodele electroforetice sunt singurele care limitează la maximum aceste interferenţe şi oferă rezultate pline de acuratete.

 

Metoda de determinare Tip de Hb glicată cuantificată Interferenţe
Cromatografie pe coloană Hb A1a

Hb A1b

Hb A1c

Hb A1c labilă

Hb F, Hb S, Hb C

Cromatografie de afinitate Hb A1 total Fără interferenţe
HPLC Hb A1a

Hb A1b

Hb A1c

Hb F, Hb S, Hb C
Metode imunochimice/imunoturbidimetrice Hb A1c Variante de Hb A2c şi Hb S1c
Electroforeză în gel Hb A1c

Hb A1 a+b

Hb A1c labilă

Hb F, Hb S, Hb C

Electroforeză capilară Hb A1c Fără interferenţe

Tabel 1. Principalele metode de determinare a Hb A1c si interferenţele lor.

 

Deşi cromatografia de afinitate nu este afectată de interferenţe, ea nu poate fi utilizată în uzul clinic datorită dificultăţii în realizarea ei (necesită aparatură specială) şi a timpului lung de obţinere a rezultatului. Electroforeza capilară este cea mai recomandată datorită acurateţei rezultatului şi  lipsei interferenţelor.

 

Metode de separare bazate pe diferenta de sarcina electrica

Hb A1c si Hb A0 prezinta proprietati diferite ce permit separearea lor si determinarea Hb A1c ca procent din Hb totala (Hb A1c + Hb A0).

 

Cromatografia de lichide de inalta performanta(HPLC Ion Exchange Chromatography)

Se bazeaza pe diferenta de punct izoelectric pI între Hb A1c si Hb A0. Diferenta de 0.02 unitati de pI este suficient de mare încât sa permita separarea celor 2 fractiuni, dar, in acelasi timp, si suficient de mica pentru a induce artefacte în cazul unor tehnici HPLC mai putin sensibile. Desi Hb F, Hb A1a+b, carbamilata si variantele anormale de Hb apar ca fractiuni distince pe cromatograma, Hb acetilata interfera în determinare. Este cea mai folosita metoda, dupa cele imunologice.

 

Electroforeza capilara prezinta avantajul unei sensibilitati, specificitati, precizii si rapiditati mult mai mari decât în cazul HPLC. Gradul de rezolutie net superior face ca principalele variante patologice de Hb (S, C, D, E), precum si variantele acetilate, carbamilate si labile sa nu interfere în determinare. Electroforeza capilarǎ permite separarea moleculelor încărcate electric funcţie de mobilitatea proprie într-un tampon cu un pH dat şi de fluxul electroosmotic (Fig.1). Separarea are loc în capilare de silicǎ (diametru mai mic de 100 µm)  umplute cu un tampon format din diverşi electroliţi. Injecţia probelor (diluate în prealabil cu tampon) se face la anod prin aspiraţie, iar separarea prin aplicarea unei diferenţe de potenţial la extremitǎţile capilarului. Densitometrarea fracţiunilor are loc la catod,  la lungimea de undă de 415 nm. La final, capliarele sunt spălate cu soluţie de spălare specificǎ şi apoi cu soluţie tampon.

Untitled1
Fig 1. Principiul electroforezei capilare.

 

Cromatografia de afinitate prezinta dezavantajul unui grad de rezolutie mai mic si interferenta Hb patologice în determinare, evaluând global fractiunea de Hb glicata (GHb), nu numai Hb A1c. Resturile de glucoza din structura GHb prezinta afinitate fata de acidul boronic, în timp ce fractiunea neglicata nu.

 

Metode de determinare bazate pe diferenta de structura

 

Metodele chimice implica doua determinari independente: pe cea a Hb total si pe cea a Hb A1c. Hb totala este determinata spectrofotometric, în timp ce concentratia Hb A1c este masurata pe baza unei reactii specifice la resturile glicate de la Val N-terminala din structura lantului β a Hb. Pe baza celor doua rezultate se poate determina valoarea Hb A1c ca procent din Hb totala, ceea ce induce, însa, un grad de imprecizie mare consecutiv cumularii factorilor de interferenta in cele doua determinari. Totusi, datorita aplicabilitatii lor pe majoritatea analizoarelor de biochimie, metodele chimice sunt utilizate, încacara larga.

 

Metodele imunologice se bazeaza pe o reactie de inhibitie imunoturbidimetrica ce decurge în 2 etape. In prima etapa, Hb A1c din proba de analizat reactioneaza cu un exces de anticorpi anti Hb A1c, rezultând complexe antigen-anticorp solubile. In a doua etapa se adauga polihaptene ce reactioneaza cu anticorpii anti Hb A1c în exces, formând complexe anticorpi- polihaptene ce vor fi determinate imunoturbidimetric. Ca si  cazul metodelor chimice, detrminarea Hb totala se face prin reactie colorimetrica. Metodele imunologice prezinta dezavantajul interferentei altor epitopi asemanatori structural cu Hb A1c.

 

 Metodele enzimatice utilizeaza o proteaza specifica cu rol in clivajul proteolitic al lantului β si eliberarea resturilor de fructozil peptide (cel mai adesea dipeptide). Sub actiunea fructozil peptid oxidazei, fructozil dipeptidele genereaza Hb A1c într-o concentratie direct proportionala cu GHb.

 

Bibliografie selectiva

 

  1. – www.ngsp.org
  2. – Chiva A.- Actualităţi în diagnosticul electroforetic de laborator, Ed. Universitară “Carol Davila”, 2011.
  3. – Dati F, Metzmann E-Proteins- Laboratory testing and clinical use- DyaSys Diagnostic Systems GmbH, 2005.
  4. – Garry John W, Mosca A, Weykamp C, Goodall I.- Hb A1c Standardization: History, Science and Politics. Clin Biochem Rev 2007; 28(4): 163-168.
  5. – Hare MJL, Shaw JE, Zimmet PZ- Current controversies in the use of haemoglobin A1c. J Intern Med 2012;271:227-236.
  6. – Mostafa SA et al..- Should glycated haemoglobin (Hb A1c) be used to detect people with type 2 diabetes mellitus and impaired glucose regulation? Postgrad Med J 2010;86:656-662.
  7. – Mostafa SA et al.- The potential impact and optimal cut points of using glycated haemoglobin  Hb A1c to detect people with impaired glucose regulation in a UK multi-ethnic cohort. Diabetes Res Clin Pract 2010; 90(1):100-8.
  8. – Urrechaga E- High resolution Hb A1c separation and hemoglobinopathy detection with capillary electrophoresis. Am J Clin Pathol 2012; 138:448-456.
  9. – Weykamp C. John WG, Mosca A et al. The IFCC reference method for the measurement system of Hb A1c: a 6-year progress report. Clin Chem 2008; 54:240-248.